Puntos a tomar en cuenta para la prevención y control de la brucelosis bovina

Introducción

La prevención y control de la brucelosis en ganado bovino lechero es esencial para minimizar la exposición potencial de la enfermedad en humanos, debido a la gran dependencia en el consumo de la leche en sus distintas presentaciones sin ningún control de calidad (Wang et al., 2020). Las estrategias de control incluyen la vacunación y el sacrificio de animales infectados a través de programas de pruebas diagnósticas, así como a través de programas de vigilancia (Wang et al., 2020). El efecto de la prevención en la enfermedad ha mejorado, sin embargo, requiere inversión humana y de capital (Meng y Zhuqing, 2020), se ha demostrado que la higiene apropiada junto con las pruebas serológicas tamiz han mejorado los esfuerzos para combatir la transmisión de la enfermedad, lo que impacta la eficiencia reproductiva del hato (Haileselassie et al., 2011). El empleo de medidas de seguridad disminuye la probabilidad de transmisión, como el uso de guantes y el empleo de un amplio rango de desinfectantes, como los cuaternarios de amonio o alcohol al 70 % en manos y brazos, así como en las superficies, destruye fácilmente a la bacteria (Rodríguez et al., 2006), así como evitar el contacto directo con la placenta, quemar los fetos y restos de placentas, los frasco de vacunas utilizados deben ser quemados evitar pinchazos accidentales al utilizar la vacuna de la brucelosis (Gil y Samartino, 2001; Wang et al., 2020). La escasa conciencia sobre la prevención ha llevado a la inadecuada prevención de epidemias de brucelosis bovina. Es necesario analizar la situación actual y formar personal altamente capacitado para la prevención de epidemias, las medidas que se deben poner en marcha, son; cuarentena de los animales que entran como reemplazos, la vigilancia de la enfermedad y la capacitación periódica del personal (Meng y Zhuqing, 2020).

Se ha reportado que la brucelosis ha sido bien controlada mediante programas y campañas nacionales en donde la vigilancia epidemiológica juega un papel importante para la toma decisiones en el control y la prevención de la enfermedad y por ende reducir el efecto negativo de la brucelosis en el hato (Zhou et al., 2020; Meng y Zhuqing, 2020). En México el estatus zoosanitario es el siguiente: Baja California Sur está reconocido como libre de Brucelosis y Sonora se encuentra libre de brucelosis causada por especies lisas. El 28.99% del territorio nacional está reconocido en fase de Erradicación (Campeche, Colima, Guerrero, Nayarit, Quintana Roo y Yucatán, así como las regiones A de Aguascalientes, Baja California, Chiapas, Guanajuato, Hidalgo, Estado de México, Puebla, Oaxaca y Querétaro). La vigilancia en México se rige mediante la Campaña Nacional Contra la Brucelosis en los Animales, que se encuentra establecida en la NOM-041-ZOO-1995 y se lleva a cabo mediante la prueba de la tarjeta. La frecuencia de la enfermedad en el periodo enero- diciembre 2019 fue del 0.06% en bovinos, en donde se realizaron 4,395,154 pruebas, de las cuales 5,610 fueron positivas. En ese mismo periodo se vacunaron 361,294 cabezas provenientes de 18, 463 hatos y se registraron 8,113 hatos como libres de la enfermedad (n=1, 082,107 cabezas) (SENASICA, 2020).

Pruebas diagnósticas

El diagnóstico depende de demostrar la presencia de Brucella spp, ya sea por aislamiento, detección del antígeno o material genético, demostración de respuestas de anticuerpos o células inmuno-mediadas o mediante secuenciación del genoma de la B. mellitensis y B. abortus (Rodríguez et al., 2006). La infección activa la respuesta celular inmunomediada y la respuesta humoral, donde los anticuerpos IgM empiezan a desarrollarse durante la fase aguda y permanecen por semanas o meses, La IgG (IgG1 e IgG2) aparecen en fases crónicas, seguido de pequeñas cantidades de IgA y permanecen durante meses después de iniciada la infección (Pfukenyi et al.,2020), por esto, el diagnóstico de la enfermedad se basa mayoritariamente en la respuesta humoral, la cual aparece a partir de las 2 semanas posinfección (Fariñas et al., 2016). Las principales pruebas que se han utilizado para la detección de muestras positivas son: la prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala (RBPT), la prueba de aglutinación en tubo estándar (SAT), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el uso y la interpretación de estas pruebas combinadas es común para minimizar los errores de diagnóstico (Pfukenyi et al., 2020) (Zhou et al., 2020). Por otro lado, las pruebas diagnósticas autorizadas por la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural para especies lisas durante la Campaña Nacional contra la Brucelosis en los Animales son: ­ prueba en tarjeta. ­ prueba de rivanol, prueba de fijación del complemento y prueba de anillo en leche, las cuales deberán realizarse por un Médico Veterinario aprobado y procesadas en un laboratorio aprobado (SENASICA, 2004). Meng y Zhuqing (2020) recomiendaron inicialmente realizar un frotis teñido con tinción modificada de Ziehl-Neelson para observar la morfología de la bacteria y descartar otras bacterias que también provocan aborto (Campylobacter y Corynebacterium pyogenes) (Gibbs y Bercovich, 2011). Las pruebas diagnósticas autorizadas por la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural para especies lisas durante la Campaña Nacional contra la Brucelosis en los Animales son: ­ prueba en tarjeta. ­ prueba de rivanol, prueba de fijación del complemento y prueba de anillo en leche, las cuales deberán realizarse por un Médico Veterinario aprobado y procesadas en un laboratorio aprobado (SENASICA, 2004).

Métodos directos

Para confirmar definitivamente la brucelosis, las pruebas de elección son las de diagnóstico directo: entre estas se encuentra el cultivo con posterior identificación de la bacteria o la PCR, en la que se pueden identificar los biovariedades, esto de gran utilidad para estudios epidemiológicos. Se realiza principalmente a partir de tejidos fetales, leche, secreciones nasales o semen (Herrán et al., 2020).

Microbiológico

La identificación bacteriológica de Brucella es un complemento de los métodos inmunológicos y se ha definido como la “prueba de oro” (Selim et al., 2019; Herrán et al., 2020) ya que permite evidenciar directamente el agente causal de la enfermedad cuando se le aísla, (Fariñas et al., 2016), por lo que permite la evaluación acertada del estatus epidemiológico del ganado o de los grupos humanos, además de que permite la tipificación para conocer y rastrear el origen de la infección, sin embargo, necesita buen equipo de laboratorio y personal bien capacitado. En general, la Brucella crece en condiciones aeróbicas y en cualquier medio de cultivo; Kuzdas y Morse y el WE de Renoux, sin embargo, lo hacen mejor en medios selectivos ricos en suero ya que es esencial para aislar la biovar 2 de B. abortus como el medio Farell o incluso se le puede añadir al medio suero de bovino al 3 % o agar suero de glucosa(Rodríguez et al., 2006). Muchas cepas de B. abortus requieren de oxígeno y CO2 suplementario y su crecimiento in vitro es lento, por lo que se debe mantener la incubación al menos durante 4-6 semanas, en contraparte, Meng y Zhuqing (2020) mencionan que se puede observar a simple vista después de una semana de cultivo y Salem et al. (2019) menciona que a partir de 2 semanas. La Brucella no se incluye en las bases de datos comerciales para la identificación de bacterias gramnegativas, por lo que la inoculación en algunos de ellos es erróneamente identificada como Moraxella sp. o Haemophilus influenzae (Rodríguez et al., 2006). Se ha descrito la existencia de reacción cruzada con bacterias gramnegativos: E. coli 0:157, E. hermanni, Salmonella 0:30, Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio cholerae y Yersinia enterocolitica, debido a determinantes antigénicos comunes presentes en la cadena O del lipopolisacárido (Rodríguez et al., 2006; Fariñas et al., 2016).

De acuerdo con la NOM-041-ZOO-1995 se debe realizar en muestras de leche, sangre, líquidos corporales o fragmentos de tejidos, que se remitirán al laboratorio aprobado para que se realice el diagnóstico. La presencia de Brucella spp en cualquiera de las muestras, significa que el animal es positivo, aun en ausencia de anticuerpos demostrables por los métodos serológicos (SENASICA, 2020). Se sabe que los aborto son la fuente principal de investigación de la enfermedad y se pueden utilizar como muestra, la leche se investiga bien a nivel individual (vaca con serología negativa y RT positivo) o bien de forma colectiva como complemento de otros exámenes, ya que el 80% de los animales infectados excretan la bacteria por esta vía, así como tejidos extraídos en el matadero, como; ganglios retromamarios, ilíacos, retrofaríngeos y parotídeos o bazo, mamá o útero (Fariñas et al., 2016).

Molecular

Se han utilizado varios estudios moleculares PCR específicos del género Brucella dirigidos a la secuencia de bcsp31 en animales, incluye la secuencia de nucleótidos a nivel de género, especie y biovariedad. El aislamiento y la descripción molecular de la Brucella prevalente son útiles para determinar el origen de la infección y tomar las medidas adecuadas para controlar la brucelosis (Selim et al., 2019).

Métodos indirectos

Brucella está formada por una membrana externa, compuesta por fosfolípidos, lipopolisacáridos y proteínas, membrana citoplasmática interna rodeada de una capa de proteoglicano y cuya estructura antigénica es compleja. En fase lisa, el antígeno inmunodominante es el lipopolisacárido (s-LPS) que contiene dos epítopos (A y M) el cual es responsable de la reacción antígeno-anticuerpo utilizada como base de las pruebas de diagnóstico serológico habituales en la práctica clínica (Rodríguez et al., 2006). La detección de anticuerpos proporciona solo un diagnóstico provisional, pero en la práctica es el medio de diagnóstico más factible y económico, existen dos tipos de pruebas serológicas actualmente: las pruebas que miden directamente la unión primaria del antígeno-anticuerpo; ELISA y FPA, y en las que se observan consecuencias fisiológicas de la unión antígeno-anticuerpo; FC, RBT y SLT (Gibbs y Bercovich, 2011). Las reacciones falsas positivas a las pruebas serológicas pueden ocurrir por varios factores, incluida la vacunación, y esto debe tenerse en cuenta al interpretar los resultados, por otro lado, si la enfermedad se vuelve crónica, los niveles de anticuerpo disminuyen, desapareciendo entre 2 y 3 años posinfección generando falsos negativos en este tipo de pruebas (Fariñas et al., 2016), sin embargo, la OIE recomienda estas pruebas para vigilancia y el desarrollo de programas de salud pública en países desarrollados (Herrán et al., 2020). De acuerdo con la NOM-041-ZOO- 1995, la prueba en tarjeta. ­ prueba de rivanol, prueba de fijación del complemento y prueba de anillo en leche se realizarán en hembras mayores de 22 meses de edad que recibieron la dosis clásica de vacuna cepa 19 (Vacuna S19) entre los 3 y 6 meses de edad, en hembras vacunadas con dosis reducida, a los 10 meses después de la fecha de vacunación, en hembras sin previa vacunación y en machos enteros, el muestreo se debe realizar a partir de los 6 meses de edad (SENASICA, 2020)

Seroaglutinación lenta en tubos (SLT)

La seroaglutinactón lenta en tubos (SLT), tiene una Se del 81% y una S del 98% (Gibbs y Bercovich, 2011), es precursora de las pruebas serológicas actuales, todavía se sigue empleando y se ha utilizado, asociada a la fijación de complemento o al ring test (RT). La SLT pone en evidencia los anticuerpos de los tipos IgG2 e IgM. Entre sus desventajas: detección tardía de los animales infectados recientemente, imposibilidad de diferenciar los anticuerpos vacunales de los de infección y el no detectar eficazmente la infección crónica o a titulaciones bajas y difíciles de interpretar.

Prueba de tarjeta – Rosa de Bengala (RBT)

Es una prueba aprobada por la OIE en donde los antígenos de Brucella (S-99) teñidos con rosa de bengala y acidificados, se ponen en contacto con la muestra de suero de animales que no hayan sido previamente vacunados y que tengan 6 meses de edad (Haileselassie et al., 2011; Pfukenyi et al., 2020), si esta contiene anticuerpos, se producirá una aglutinación a simple vista. El antígeno de la prueba se acidifica ya que, a pH neutro, la reacción de aglutinación es más activa en la de IgM, por lo que acidificando el pH previene su aglutinación y favorece la de la IgG (Fariñas et al., 2016). Esta prueba es considerada como prueba de tamizaje (Haileselassie et al., 2011) es económica, sencilla y rápida, tiene una Se del 78 % y una Sp del 71% (Gibbs y Bercovich, 2011) en contraste, Pfukenyi et al (2020) alcanzaron una Se del 89.7 % y una Sp del 96.9 %, sin embargo, la baja Sp permite identificar falsos positivos, lo que se ocasiona tener que realizar pruebas complementarias con mayor Sp, como ELISA o FC (Gibbs y Bercovich, 2011). De acuerdo con la NOM-041-ZOO-1995 esta prueba se debe realizar en suero y con antígeno autorizado, que reúna las siguientes características: a) Elaborado con la cepa 1119­3 de Brucella abortus, b) Teñido con rosa de bengala en ácido láctico. c) pH de 3.65 ± 0.05, d) Concentración celular del 8% para bovinos y del 3% para caprinos y ovinos. Los resultados arrojarán: positivos (presencia de aglutinación) y negativos (ausencia de aglutinación) (SENASICA, 2020).

Prueba de rivanol

Es una prueba que diferencia entre ganado vacunado e infectado, tiene una Se del 56% y una Sp del 97%, no es aplicable para infecciones agudas (Gibbs y Bercovich, 2011). Esta prueba se realiza en suero de bovino positivo a la prueba de tarjeta, con antígeno (cepa 1119­3 de Brucella abortus) y reactivo de rivanol (lactato de 2 etoxi 6,9 diamino acridina). ­ El antígeno debe reunir las siguientes características: a) Teñido con una mezcla de verde brillante y cristal violeta, b) pH 5.8 a 6.2, c) Concentración celular del 4%. Se consideran positivos, todos aquellos sueros de animales no vacunados que presenten reacción de aglutinación completa en cualquiera de las diluciones, desde 1/25 a 1/400 y en bovinos vacunados si hay aglutinación completa en una dilución mayor o igual a 1/50 (SENASICA, 2020).

Prueba de fijación del complemento (FC)

Es una prueba aprobada por el manual de pruebas diagnósticas y vacunas de los animales terrestres de la OIE que detecta la infección aguda, en donde los antígenos de Brucella se ponen en contacto con la muestra de suero y con proteínas del complemento (Gibbs y Bercovich, 2011; Pfukenyi et al., 2020). En una prueba positiva el complemento se une al complejo antígeno-anticuerpo. En una segunda fase se añaden eritrocitos junto con anticuerpos anti-eritrocitos, si el complemento se une al complejo eritrocito-anticuerpo anti-eritrocito desencadenando hemólisis, es una prueba negativa. Detecta los anticuerpos IgG1 y IgM, permitiendo una relativa diferenciación entre anticuerpos vacunales e infecciosos (Fensterbank, 1986), esta prueba tiene una Se del 70 % y Sp del 99.9 % (pocos falsos positivos), por lo que se utiliza como prueba confirmatoria de otras pruebas, sin embargo, es una prueba larga de efectuar y compleja en comparación con el de rosa de bengala por lo que impide su utilización regular como prueba de base y se utiliza como prueba confirmatoria de otras pruebas (Fariñas et al., 2016; Gibbs y Bercovich, 2011; Pfukenyi et al., 2020). De acuerdo con la NOM-041-ZOO-1995 Se debe realizar con sueros positivos a las pruebas de tarjeta y/o rivanol. Para la prueba se empleará antígeno cepa 1119­-3 de Brucella abortus, sin teñir y con las siguientes especificaciones: a) pH 6.8 a 7.0, b) Concentración celular de 4.5% Los positivos serán aquellos en los que se obtengan títulos mayores a 1/16 en frío o mayores a 1/8 en caliente (SENASICA, 2020).

ELISA

Es la única prueba que puede diferenciar entre anticuerpo vacunales y los provocados por la infección (Fariñas et al., 2016), tiene una Se 96% y Sp 81% para IgM y una Se de 77 % y una Sp del 87 % para IgG (Gibbs y Bercovich, 2011) Se ha reportado una Se del 87.3 % y Sp 92 % en leche (Wang et al., 2020).

ELISA indirecto: Se puede realizar en suero o leche y consiste en la reacción del antígeno (LPS) con los anticuerpos de las muestras, el complejo antígeno-anticuerpo es detectado por un segundo anticuerpo marcado que reconoce de forma genérica anticuerpos de bovinos. Es una prueba fácil, de sencilla interpretación y de alta sensibilidad (Fariñas et al., 2016; Shell et al., 2021).

ELISA de competición: Se basa en que los anticuerpos vacunales tienen mayor afinidad por el antígeno que los producidos durante la infección, debido al corto tiempo de exposición al antígeno en el caso de la vacuna. Por lo que selecciona un segundo anticuerpo marcado que no se une a los anticuerpos vacunales, pero sí a los generados tras la infección. Esta prueba es más específica pero menos sensible que el ELISA indirecto (Fariñas et al., 2016). Actualmente se ha propuesto el uso de la proteína EryC como antígeno, en donde encontraron que el suero infectado naturalmente por Brucella, dio una seropositividad del 94.7 %, mientras que la muestras con suero infectado por antígenos vacunales S19 fueron negativas, sin embargo, se requiere seguir haciendo investigación con un mayor número de animales y el aislamiento bacteriano para probar la Se y Sp de la proteína para diagnosticar el antígeno (Shell et al., 2021).

Prueba de anillo en leche (RT)

Esta prueba es común realizarla en ganado productor de leche ya que detecta las inmunoglobulinas existentes en la leche, ya sea procedentes de la sangre por filtración (IgM) o bien producidas localmente en la mama (IgA) en la cual se utiliza antígeno teñido con hematoxilina que se agrega a la muestra de leche, si hay anticuerpos se unirán al antígeno y aparecerá una banda del color de la hematoxilina en la parte alta de la muestra correspondiente al glóbulo graso ya que los anticuerpos tienen afinidad a éste, así como al antígeno coloreado (Fariñas et al., 2016). Es muy sencilla de realizar, eficaz, y económica, por lo que puede efectuarse de forma frecuente (cada mes) tanto para el control de hatos lecheros infectados como para el seguimiento continuo de los rebaños saneados. Sin embargo, tiene una Se 56% y una Sp del 99 % (Gibbs y Bercovich, 2011), además la Se disminuye con el tamaño del rebaño, se menciona que la adición de formol (concentración final 0,2%) a la leche permite conservarla durante 14 días y parece aumentar la sensibilidad de la prueba, además los resultados deben confirmarse con pruebas serológicas. De acuerdo con la NOM-041-ZOO-1995 se debe practicar en muestras de leche cruda, fluida y fresca, realizándose con antígeno autorizado, con las siguientes características: a) Teñido con hematoxilina, b) pH entre 4.0 y 4.3, c) Concentración celular de 4%. Los resultados se interpretarán como negativos en ausencia de anillo teñido y positivos los que presenten anillo teñido en la superficie (SENASICA, 2020).

Intradérmica

Las pruebas de detección de respuesta de inmunidad celular se utilizan con poca frecuencia, sin embargo, son útiles como pruebas complementarias en granjas donde existe la infección con el fin de aumentar la detección de animales infectados (Fariñas et al., 2016). Esta prueba detecta portadores latentes y se basa en la reacción de hipersensibilidad retardada (IV), ya que la infección por Brucella crea un estado de sensibilización que se puede poner en evidencia mediante la inyección de alérgenos extraídos de brucelosis, los cuales son proteínas de la membrana externa (OMP) o de origen intracelular (Rodríguez et al., 2006) lo que provoca una reacción inflamatoria local de base celular que se percibe a simple vista y desencadenada por citocinas que producen los linfocitos T que han sido activados tras una infección bacteriana. Se debe inyectar 0.1 ml de alérgeno, en el pliegue caudal, en la piel de la ijada o en un lado del cuello. Esta prueba solo indica una exposición previa al organismo, no necesariamente una infección activa, y también puede resultar de la vacunación (Corbel, 2006) por otro lado, Fariñas et al. (2016) indicaron que esta prueba es muy específica, de modo que los animales no vacunados serológicamente negativos pero reactivos a esta prueba, se considerarán positivos y que tiene una Sp del 99% y una Se del 60-81% (Gibbs y Bercovich, 2011) y prevé su utilización para un diagnóstico conjunto de tuberculosis y brucelosis. Además, presentan la ventaja de no provocar la formación de anticuerpos que se evidencien por las pruebas serológicas de rutina y de no producir sensibilización, así pues, se puede repetir este diagnóstico sin interferir en los diagnósticos serológicos o alérgicos posteriores. Se ha propuesto este método para el control de rutina y como prueba suplementaria en los rebaños donde existan problemas.

Técnica de Polarización Fluorescente (FPA)

Las pruebas positivas en RBT se someten a esta prueba y a ELISA de competición para confirmar el diagnóstico (Herrán et al., 2020) o a FC (Pfukenyi et al., 2020).

Prueba de flujo lateral (LFA)

Prueba inmunocromatográfica que detecta IgG e IgM en suero de bovino infectado expuesto a Brucella lisa usando un anticuerpo específico antibovino marcado con nanopartículas de oro, es altamente sensible (82.7%) y específica (99.6 %), sin embargo, no se ha probado la detección de anticuerpos de Brucella en condiciones de campo (Pfukenyi et al., 2020).

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Fuente: ganaderia.com