Resumen
Objetivo. Determinar el efecto de la suplementación con silo de maíz en la expresión de genesasociados al contenido de grasa intramuscular en el músculo longissimus dorsi de novillos Braford. Materiales y Métodos. Se utilizaron 30 novillos Braford. Durante 120 días 15 animales fueronsuplementados con silo de maíz al 1% de su peso vivo (Supl), y 15 animales fueron alimentados solamente en pastura tropical (Cont). La faena se realizó a los 26 meses de edad con 464±17 Kg. Mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR), se determinó la expresión de los genes transportador de glucosa 4 (glut4), factor de crecimiento tipo insulínico 1 (igf1) y miostatina. La expresión de genes fue asociada con parámetros de calidad de la canal y de la carne. Resultados. La suplementación con silo de maíz produjo mayor expresión de los genes glut4 e igf1. La expresión de los genes estudiados fue correlacionada con el peso de la carcasacaliente, el engrasamiento de la canal y el contenido de grasa de la carne. Conclusiones. Estos resultados sugieren interacción expresión genética-dieta en los genes glut4 y igf1, la cual impactan en el engrasamiento de la canal y el contenido de grasa intramuscular en músculo longissimus dorsi de los novillos Braford, sugiriendo que estas variables podrían ser moduladas a través de la expresión diferencial de los genes.
Palabras clave. Bovinos; maíz; novillo; suplementos alimentarios; tejido adiposo (Fuente: AGROVOC).
INTRODUCCIÓN
La calidad de la carne es percibida principalmente por atributos sensoriales como la apariencia, la jugosidad, el sabor, y la textura (1). La textura depende de varios factores: de características zootécnicas del animal (raza, edad y sexo), de características anatómicas (tipo de músculo), de factores ajenos a los animales (alimentación), del procesamiento post mortem (maduración) o del método de cocción (2,3).
La grasa intramuscular o “veteado” de la carne se ha convertido en un elemento que define la calidad de la canal en la industria de carne bovina (4).
Desde el punto de vista del desarrollo y crecimiento, el depósito de grasa intramuscular es el último paso del proceso de crecimiento y se produce en la etapa de terminación de los animales. En este sentido, se ha determinado que, durante el crecimiento de los animales, existe una interacción entre adipogénesis y miogénesis; el aumento del contenido de fibras musculares genera un menor contenido de grasa intramuscular (5).
El trasportador de glucosa 4 ( glut4) es un transportador de glucosa de alta afinidad, que se expresa altamente en el tejido adiposo y muscular, y es sensible a la insulina. Desempeña un papel importante en las funciones energéticas / metabólicas de los adipocitos al permitir el transporte de glucosa a la célula (6). Estudios realizados en ratas demuestran que, dietas con elevado contenido energético, aumentan la expresión del gen glut4 (7). A su vez, la expresión del gen glut4 se vio aumentada en el músculo esquelético del ganado con el fenotipo “doble musculatura”, que contiene el gen de la miostatina inactivado, con respecto a animales sin dicha mutación (8). Estos autores sugieren que el gen de la miostatina, (mstn, o factor de crecimiento y diferenciación 8), interviene en el metabolismo de glucosa y la acumulación de grasa, comportándose como un inhibidor directo de la expresión del gen glut4 (8).
Por otro lado, el gen del factor de crecimiento insulínico tipo 1 (igf1) forma parte de la familia de proteínas mediadoras del crecimiento y desarrollo, participando en la diferenciación celular, embriogénesis, crecimiento y regulación del metabolismo. Estudios previos realizados en razas Angus y Charolesa demostraron asociación entre polimorfismos presentes en igf1 con la deposición de grasa muscular y otros atributos de calidad de carne (9,10,11). Asimismo, se ha determinado que el gen igf1 modifica su expresión en función de la dieta. El aumento de ingesta de energía incrementa el estado de energía celular y con ello la expresión génica lipogénica mediante la promoción de la secreción de igf1, causando un aumento del contenido de grasa intramuscular (12).
Se ha determinado que el sistema de producción del ganado de carne utilizado (pastoril, pastoril más suplementación, confinamiento) impacta en la composición química de la carne y el contenido de grasa, aspectos claramente relacionados la calidad de la carne (13,14). A su vez, se sugiere que los sistemas de producción de razas carniceras en condiciones extensivas permiten lograr carnes con un excelente perfil de ácidos grasos (13) . En este contexto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la suplementación con silo de maíz, sobre la expresión de los genes igf1, glut4 y mstn en el músuculo longissimus dorsi de novillos Braford terminados en pasturas tropicales y su asociación con características de la canal y de la carne.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Biológico. El estudio se realizó enun rodeo comercial de la provincia de Santiago del Estero, norte de Argentina (S 27° 17’34,3’’ -W0 62° 15’14,1’’). Durante todo el periodo experimental los animales estuvieron manejados siguiendo los protocolos de Bienestar Animal del Servicio Nacional de Sanidad Animal (SENASA). Los animales fueron criados y faenados según lo descripto en Coria et al (15). Brevemente, se trabajó con 30 novillos Braford, de 22 meses de edad, criados en un sistema de pastoreo extensivo sobre pasturas tropicales. El ensayo experimental comenzó en el mes de Noviembre (primavera) y tuvo una duración de 120 días. Los novillos fueron divididos al azar en 2 grupos experimentales de 15 animales cada uno y fueron asignados a potreros con Megatyrsus maximus. Durante 120 días uno de los grupos (Cont) continuó pastoreando en el potrero, mientras que el otro (Supl) recibió suplementación con silo de planta entera de maíz al 1% de su peso vivo generando aumentos de ganancia diaria de 0.85 kg/día y 1.01 kg/día, respectivamente. Ambos grupos tuvieron acceso ad libitum al agua y fueron pesados al final del ensayo alcanzando pesos de 455±16 Kg en el grupo Cont y 473±18 Kg en el grupo Supl (p=0.05).
Una vez concluido el período de alimentación establecido (120 días), los animales fueron enviados a faena con una edad promedio de 26 meses. Para ello, los animales fueron transportados en forma conjunta hasta el Frigorífico, el cual se encuentra aproximadamente a 210 km del establecimiento de donde procedían los animales. Los mismos fueron insensibilizados utilizando un martillo neumático, y faenados siguiendo los protocolos de Bienestar Animal del SENASA.
Inmediatamente después de la faena, las carcasas fueron pesadas (PCC: Peso de la carcasa caliente). El PCC del grupo Cont fue 264±15 Kg, y del grupo Supl 298±17 Kg (p<0.05). Se determinó el grado de engrasamiento según el Sistema de Tipificación de Canales Bovinas Argentino (Junta Nacional de Carne, Resolución J-378/73 de la SAGPSyA). Basada en una apreciación visual de la cantidad y la distribución de la grasa subcutánea, el engrasamiento puede tomar valores entre 1 y 4. Valores elevados indican mayor espesor de este depósito. Las canales del grupo Cont presentaron valores de engrasamiento 1±0.0 y las del grupo Supl 1.7±0.5 (p<0.05).
En el momento del sacrificio se tomaron 500 mg de músculo para realizar análisis de expresión de genes. Los mismos fueron almacenados a -70°C hasta su posterior análisis.
Extracción de ARN. Se extrajo ARN total delas 30 muestras de músculo mediante el método de Fenol-Cloroformo empleando TriReagent® (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN total se re suspendieron en H2O libre de ribonucleasas y se determinó la concentración e integridad del ARN obtenido, cuantificando la absorbancia a 260 nm utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000c UV-Vis (Thermo Scientific), y por electroforesis en geles de agarosa teñidos con Syber Green (Biotium).
Síntesis de cDNA. Previo a la síntesis de cDNA serealizó el tratamiento con DNAsa (AMPD1-Sigma) según indica el fabricante. Posteriormente, se realizó la síntesis de cDNA con 1200 ng de ARN total siguiendo el protocolo de la enzima Super ScriptIII (Invitrogen).
Análisis de la expresión de genes por PCR cuantitativa. Los niveles expresión de los genesfueron determinados por medio de RT-qPCR utilizando cebadores específicos por triplicado en todas las muestras. Los cebadores (Tabla 1) fueron previamente validados para obtener una eficiencia adecuada, y su especificidad fue confirmada en electroforesis en geles de agarosa al 1.5% y posterior secuenciación. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en un volumen final de 10 μL, conteniendo 3 μL de cDNA [dilución 1:3], 0.25 mM de cebadores y 5 μL de la Supermix iTaq™ Universal SYBR® Green (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en el termociclador CFX96 Real-Time (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Tabla 1. Cebadores utilizados en RT-qPCR.
El programa de PCR constó de una desnaturalización inicial de 5 minutos a 95°C, seguida de 50 ciclos de 30 seg a 95°C, hibridación de 30 seg a 58°C y extensión de 30 seg a 60°C. Al finalizar la reacción se realizó la curva de melting para todos los genes. A su vez, se realizaron controles negativos para excluir la posibilidad de contaminación con ADN.
RESULTADOS
En la Figura 1 se presentan los resultados de expresión relativa de los genes evaluados. En este sentido, la suplementación de los novillos con silo de maíz genera un aumento de los niveles relativos de expresión de los genes igf1 y glut4 (1.24, p=0.049 y 2.18 p=0.049,respectivamente) en comparación con los novillos terminados a pasto. Sin embargo, no se observaron diferencias en la expresión del gen de la miostatina (0.34, p=0.46).
Figura 1. Expresión relativa de los genesigf1, glut4ymstn en muestras de longissimus dorsi deanimales terminados en pasturas tropicales (Cont) o con suplementación de silo de maíz (Supl). Los resultados del tratamiento suplementado fueron normalizados con el tratamiento pastura.
En la Tabla 2 se muestran los coeficientes de correlación estadísticamente significativos, obtenidos para los genes igf1, glut4 y mstn y las características de calidad de la canal y de la carne. Se debe resaltar que la expresión del gen igf1 se encuentra asociada de manera directa conla expresión del gen glut4 (r=0.98, p<0.001) y de manera inversa con la expresión del gen mstn (r=0.97, p<0.001).
A su vez, la expresión de estos genes se encuentra correlacionada con el peso de la carcasa caliente (p<0.001), el grado de engrasamiento de la canal (p<0.001) y el contenido de grasa intramuscular (p<0.05).
Tabla 2. Coeficientes de correlación entre losparámetros instrumentales relativos a la calidad de las canales y la carne y la expresión de los genes igf1, glut4 y mstn.
DISCUSIÓN
La suplementación con silo de maíz produjo expresión diferencial de los genes igf1 y glut4. En este sentido, previamente se ha determinado que el incremento de energía en las dietas aumenta el estado de energía celular y ello podría generar un aumento en la expresión génica lipogénica mediante la secreción del igf1 y del gen glut4, generando un aumento del contenido de grasa (7,12). En concordancia con los resultados obtenidos, Pfaffl et al (21), obtuvieron mayor contenido de grasa intramuscular y expresión del gen igf1 en novillos Simmental alimentados con silo de maíz con respecto a novillos alimentados con pastura y heno. Asimismo, Ladeira et al
(22) demostraron que la expresión del gen glut4 en el músculo esquelético puede ser alterada incorporando suplementos en las dietas. En este sentido, Hocquette et al (5) sugieren que las dietas basadas en granos aumentan la conversión de glucosa en grasa intramuscular, en comparación con dietas basadas en pasto, explicando los resultados obtenidos.
Por otro lado, la expresión del gen mstn no se vio afectada por la suplementación. Trabajos anteriores realizados con ganado de “doble musculatura”, cuyo gen de la mstn se encuentra mutado, reportaron un incremento de masa muscular y una disminución en la cantidad de la grasa intramuscular (23). A su vez, se ha demostrado que bajas concentraciones o la inactivación de la miostatina, producen un aumento de la expresión del gen glut4 (8). Estos autores sugieren que la miostatina es un inhibidor directo de la expresión del gen glut4. En concordancia con los resultados obtenidos en el presente trabajo, otros autores han determinado en el ganado doble musculatura que la expresión de mstn disminuye mientras que la expresión de igf1 se mantiene constante (18). El aumento de la expresión de los genes glut4 e igf1, en conjunto con el aumento de peso, cobertura de grasa o engrasamiento de las carcasas y el contenido de grasa intramuscular de la carne en el grupo de animales suplementados con silo de maíz, explicarían la relación entre los procesos de adipogénesis y miogénesis, detallada en la bibliografía (5,24).
En conclusión, el contenido de grasa intramuscular de la carne es de gran importancia en la industria cárnica, determinante de la calidad del producto, pero difícil de medir y de seleccionar por los métodos clásicos. Los resultados del presente trabajo indican que las diferencias obtenidas en el contenido y distribución de grasa de las reses, y el peso de las canales puede ser parcialmente explicada por las variaciones en la expresión de los genes igf1, mstn y glut4. A su vez, la suplementación con sílo de maíz produce un aumento en la expresión de los genes igf1 y glut4 en el músculo longissimus dorsi de novillosBraford, lo cual podría explicar las diferencias obtenidas en el contenido de grasa intramuscular de este grupo. En este sentido, los resultados obtenidos contribuyen al conocimiento de los procesos biológicos de adipogénesis y deposición de grasas en el ganado bovino.
Conflicto de intereses
Los autores certificamos que no existe conflicto de intereses con ninguna organización financiera con respecto al material discutido en el manuscrito.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer al Dr. Eduardo Alberto Parellada por su asistencia técnica en las determinaciones realizadas y al Programa de Intercambio y Movilidad Académica (PIMA) que permitió la estancia de la Ing. Zoot Álvarez-Gutiérrez. El presente trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas [PUE 2018 0035], el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria [PD-E5-I107-001] y la Universidad Nacional de Santiago del Estero [UNSE 23/A262].
