Resumen
En Argentina, el uso de anabólicos como promotores de crecimiento en la producción bovina está prohibido. Sin embargo, la presencia de la toxina fúngica zearalenona (ZEA) en pastos destinados a consumo animal como contaminante natural, puede generar resultados falsos positivos en el control de anabólicos, por la aparición de zeranol en orina, el cual es un derivado del metabolismo de la toxina. Como objetivo del presente estudio se consideró de interés analizar la presencia natural de micotoxinas producidas por el género Fusarium, incluida la ZEA y sus derivados, mediante LC-MS/MS, en pastos naturales destinados a la alimentación bovina en dos establecimientos ganaderos del este de Chaco, donde SENASA había detectado zeranol en orina de ganado. El análisis reveló la presencia de ZEA en el 90% de las muestras analizadas (media: 84,5 µg/kg), también se detectó α y β-zearalenol. Además, se detectaron algunos metabolitos con probada toxicidad en rumiantes como son los tricotecenos tipo A, tales como toxina T-2 y toxina HT-2 los cuales estaban presentes en alta frecuencia (63 y 50% respectivamente) y en concentraciones superiores a 5000 µg/kg en algunas muestras. Se encontraron también otros metabolitos producidos por Fusarium en muy alta frecuencia como beauvericina, equisetina y aurofusarina. Como segundo objetivo se planteó estudiar la variación estacional de las micotoxinas presentes en pastos naturales destinados a la alimentación bovina, con el fin de verificar si la presencia de ZEA y de otros metabolitos en pastos naturales (no cultivados) es un evento frecuente o esporádico y dilucidar si existe variación temporal en las micotoxinas de Fusarium. Para ello, en el año 2014 se muestrearon un total de 67 plantas que pertenecían a 13 géneros diferentes dentro de la familia Poaceae en dos periodos diferentes del año: febrero y septiembre. La mayoría de las muestras (98%) presentaron contaminación con micotoxinas, siendo las más prevalentes ZEA, toxina T-2, beauvericina, toxina HT-2 y aurofusarina. También se encontraron con baja frecuencia otras micotoxinas producidas por Fusarium como: neosolaniol y diacetoxiscirpenol. A partir de los resultados obtenidos fue posible explicar los niveles de zeranol encontrados en la orina del ganado bovino.
Introducción
La actividad ganadera es uno de los grandes pilares de la economía argentina, concentrándose principalmente en la región Pampeana, seguida de Noreste, Patagonia, Noroeste y Cuyo. Estas regiones presentan climas templados y subtropicales que permiten el desarrollo de pastizales naturales, pasturas y verdeos estacionales, constituidos principalmente por especies de la familia Poaceae (Gramíneas), representando el sustento nutricional de la ganadería en su conjunto, obteniéndose, de esta forma, cortes de carne más magros con menos colesterol y ácidos grasos poliinsaturados que aquellos cortes de carne obtenidos luego de una dieta alta en granos administrada en corrales de engorde (feedlot) (Arelovich et al., 2011). Dentro de los principales países importadores de carne Argentina se encuentra China, Chile, países de la UE como Alemania, Italia y Holanda, entre otros. La UE exige a aquellos países exportadores de carne los mismos controles o garantías equivalentes a sus normas sanitarias, es decir que la carne vacuna producida en Argentina destinada a la UE debe provenir de animales que nunca hayan sido tratados con hormonas (anabólicos). Estos esteroides pueden ser de origen endógenos (naturales) o sintéticos. Dentro de los anabólicos esteroides sintéticos se ubica el zeranol (Bavera et al., 2002). Por lo explicado anteriormente, en nuestro país se monitorea la administración ilegal de anabólicos a los animales mediante su detección en la orina de ganado vacuno a través de cromatografía gaseosa asociada a espectrometría de masa (GC-MS) (SENASA, 2007). En Argentina, el uso de compuestos anabólicos para la producción de carne bovina está regulada por el Codex Alimentarius, el SENASA y por normativas internacionales (Aráoz, 2004). Sin embargo, existe una micotoxina producida principalmente por especies de Fusarium denominada zearalenona (ZEA), que es capaz de biotransformarse en otra toxina conocida como α-zearalanol, químicamente similar al zeranol (anabólico). La estructura química de la ZEA corresponde a una lactona fenólica del ácido resorcílico, estrechamente relacionada con los metabolitos estrogénicos, correlacionándose con la actividad anabolizante del zeranol y su uso en la alimentación como un promotor del crecimiento animal. Los derivados de la ZEA son: α-zearalenol (α-ZEA), β-zearalenol (β-ZEA), α-zearalanol (α-ZAL o zeranol), β-zearalanol (β-ZAL), zearalanona (ZAN). Kennedy et al. (1998) y Smith (2006) demostraron que el zeranol (α-ZAL) puede ser formado in vivo en el rumen de bovinos a partir de metabolitos producidos por Fusarium, lo cual demuestra la existencia de una fuente natural de zeranol: la presencia de ZEA y sus derivados como contaminante natural de pasturas y/o pastos naturales como ha sido demostrado en Australia y Nueva Zelandia (Reed y Moore, 2009). Es importante mencionar que, además de ZEA, las especies de Fusarium son capaces de producir un amplio rango de micotoxinas como los tricotecenos y las fumonisinas, entre las más frecuentes y tóxicas, y otras importantes como beauvericina (BEA), las eniantinas (ENN), moniliformina (MON) y aurofusarina (AUF) (Munkvold, 2017).
En el año 2010 se detectó en nuestro país zeranol en orina de bovinos de numerosos establecimientos ganaderos durante inspecciones rutinarias del SENASA en el marco del Programa Nacional de Control de Residuos, Contaminantes e Higiene en Alimentos de Origen Animal (CREHA ANIMAL). Si bien los productores afectados declararon no haber administrado este anabólico, como consecuencia de este hallazgo no se les permitió exportar (principal destino UE). Debido a que existen evidencias sobre la presencia de zeranol en orina de mamíferos, entre ellos bovinos, que solo recibieron alimentación a base de pastos (Erasmuson et al.1994, Miles et al.1996, Launay et al., 2004), y a que tanto en Australia como en Nueva Zelanda se demostró que la detección de zeranol en bovinos podría provenir del metabolismo de ZEA, la cual se encuentra de manera natural en pasturas destinadas a la alimentación bovina (Reed y Moore, 2009), se postuló que la presencia de la toxina fúngica ZEA y sus derivados como contaminantes naturales en pastos destinadas al consumo animal, puede generar resultados falsos positivos en el control de anabólicos por la aparición de zeranol (α-ZAL) en orina. De este modo la detección de zeranol en orina de un animal por sí sólo no es prueba suficiente de que ha ocurrido un abuso de esta sustancia por parte del productor. El conocimiento de esos hallazgos por parte de productores ganaderos de los Humedales de Chaco en cuyos establecimientos se había detectado zeranol en orina de bovinos y que a su vez manifestaban no haber usado esta sustancia prohibida en nuestro país, llevó a que se contactaron con nuestro grupo de trabajo, para de manera conjunta demostrar que la fuente de zeranol en la orina no era consecuencia del uso ilegal de esta sustancia, si no de la presencia natural de ZEA y derivados en los pastos naturales consumidos por el ganado: hecho nunca antes demostrado en nuestro país.
Materiales y Métodos
La zona de muestreo se localizó en el Humedal de la región del Chaco (Sitio Ramsar 1366), Argentina. Se realizaron muestreos en dos potreros de dos establecimientos ganaderos ubicados al sud-este de la Pcia. de Chaco en el mes de julio de 2011 (Figura 1), donde habían pastado los animales a los que se les detectó zeranol en orina durante la inspección rutinaria del SENASA en el año 2010. Se recolectaron, entre los dos establecimientos, un total de 106 muestras de pastos pertenecientes a la familia Poaceae. Debido a que el muestro se realizó durante el invierno (julio), no fue posible identificar las plantas recolectadas hasta el nivel de especie, ya que no presentaban inflorescencias. Las partes aéreas de las plantas, incluyendo hojas y tallos, fueron inmediatamente secadas en estufa de aire forzado a 60 ºC durante 48 horas, o hasta peso constante.
Posteriormente, para evaluar la existencia o no de una variación estacional del contenido de micotoxinas en pastos naturales, se llevaron a cabo dos muestreos correspondientes a los meses de febrero y septiembre de 2014 en uno solo de los establecimientos. Se recolectaron, entre los dos períodos del año, un total de 67 muestras de pastos pertenecientes a 13 géneros diferentes (Chloris, Cynodon, Dichantium, Diplachna, Elionurus, Eragrostis, Eriochloa, Hymenachme, Leersia, Panicum, Paspalum, Sorgastrum, Spartina) todos incluidos dentro de la familia Poaceae.
Figura 1. Mapa indicando la localización de los establecimientos a partir de los cuales se obtuvieron las muestras de pasto. 1. Establecimiento La Adela 2. Establecimiento San Francisco.
Es importante señalar que todas las muestras de pastos recolectadas en ambos años de estudio no presentaban signos de enfermedad y se utilizó como criterio de selección aquellos pastos, todos pertenecientes a la flia Poaceae, que eran más palatables para el ganado bovino. Previo a realizar la extracción de micotoxinas, las muestras fueron pulverizadas a un tamaño de partícula de 1 mm2 usando un molinillo (Cyclotech, Foss Tecator). Luego para la extracción, detección y cuantificación de micotoxinas se siguió la metodología propuesta por Sulyok et al. (2006) y Malachova et al. (2014).
Para determinar si existía alguna diferencia en cuanto a la concentración de cada metabolito en particular entre ambos años de muestreo y entre ambos períodos de muestreo, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa InfoStat versión 2018 (Di Rienzo et al., 2018). El nivel estadístico de significancia fue determinado con un p < 0,01.
Resultados
Como resultado del estudio sobre la incidencia natural de micotoxinas, producidas por hongos pertenecientes al género Fusarium, en pastos naturales muestreados en el año 2011, se detectaron un total de 17 metabolitos diferentes de un total de 50 analizados. Debido a que no se encontraron diferencias significativas (p ≤ 0,01) entre ambos establecimientos, se presentan los resultados combinados. De un total de 106 muestras de pastos naturales, se detectó la co-ocurrencia de 4 o más micotoxinas en la totalidad de las muestras analizadas. Entre las micotoxinas detectadas BEA, equisetina y monocerina estuvieron presentes en todas las muestras, mientras que ZEA y AUF en el 90% de las mismas. Otras micotoxinas de Fusarium como toxina HT-2 (HT-2), α-ZEA, ZEA-4-sulfato (ZEA-4S), toxina T-2 (T-2) y eniantina B (ENN B) presentaron una prevalencia de entre el 40-70%, mientras que neosolaniol (NEO), β-ZEA, nivalenol (NIV), moniliformina (MON) y fumonisina B1 (FB1) se detectaron en frecuencias menores al 40%. Por otro lado, diacetoxiscirpenol (DAS) y deoxinivalenol (DON) se detectaron en frecuencias menores al 10% (Figura 2).
Como resultado del segundo estudio acerca de la variación estacional de micotoxinas en pastos naturales muestreados durante febrero y septiembre del año 2014, pudo observarse que de un total de 67 muestras el 98% presentaron contaminación con micotoxinas, detectándose 17 metabolitos de Fusarium, siendo ZEA, T-2, BEA, HT-2, AUF, equisetina y monocerina las micotoxinas que presentaron mayor prevalencia en ambos períodos de muestreo con un porcentaje mayor al 30%. En general, se observó que la monocerina y la equisetina estuvieron presentes en más del 90% de las muestras, mientras que la ZEA en el 85%. Otras micotoxinas de Fusarium como T-2, HT-2 y BEA presentaron una prevalencia del 40-70%. Las micotoxinas AUF, ZEA-4S, α-ZEA y NEO se detectaron en frecuencias menores al 30%, y por último β-ZEA, ENN B, MON, DAS, NIV y FB1 se detectaron en frecuencias menores al 10%. En el primer período de muestreo, las micotoxinas detectadas en menor frecuencia fueron NEO, DAS, NIV, ENN B y derivados de micotoxinas como HT-2 glucosido (HT-2-G), α-ZEA, β-ZEA, entre otras. Mientras que en el segundo período fueron NEO, FB1, MON, DAS y derivados como HT-2-G y β-ZEA. Las micotoxinas FB1 y MON no fueron detectadas en el primer período de muestreo, mientras que NIV y ENN B no fueron detectadas en el segundo período, aunque cabe resaltar que cuando se detectaron presentaron muy baja frecuencia y concentración. No se observaron diferencias significativas ni entre los tipos, ni en los niveles de micotoxinas obtenidas en los diferentes tiempos de muestreo, teniendo en cuenta aquellas toxinas presentes en más del 10% de las muestras (Figura 2). Comparando ambos años de estudio, se encontraron diferencias significativas (p < 0,01) en los niveles de DON, BEA, ENN B y equisetina, las cuales fueron detectadas en menores niveles en el año 2014 con respecto a aquellos niveles del año 2011 (Figura 2). De un total de 18 metabolitos detectados en las muestras de pasto recolectadas durante los años 2011 y 2014, 16 se compartieron en ambos años evaluados. La lista de los metabolitos más frecuentes fue similar entre ambos años, a pesar de esto, hubo una menor prevalencia y/o menor concentración en las muestras de pasto correspondientes al año 2014.
Discusión
El presente estudio representa el primer análisis acerca de la contaminación de pastos naturales utilizados para la producción animal con micotoxinas producidas por especies de Fusarium. Se analizaron mediante LC-MS/MS un total de 173 muestras de pastos naturales, encontrando como resultado contaminación en el 99%. Es importante remarcar que el ganado vacuno que pastoreaba en los establecimientos evaluados no mostró ningún síntoma de micotoxicosis. Entre las toxinas detectadas, se incluyeron las principales micotoxinas de importancia para la salud animal: ZEA y tricotecenos (Mostrom y Jacobsen, 2011).
Así, el hecho de detectar ZEA y derivados en las muestras de pasto, nos indica que la presencia de zeranol en la orina de ganado vacuno que se alimentaba con esos pastos, pudo no haber sido una consecuencia del uso ilegal de sustancias prohibidas, pero sí pudo ser producto de la presencia natural de ZEA y α-ZEA en esos pastos. De esta manera, los resultados que presentamos líneas más arriba sirvieron como sustento para una modificación en la reglamentación (norma SENASA, resol. Nº 447/2004) por la disposición Nº 3/2012 en donde se contempla la aparición de zeranol en orina debido al metabolismo de la micotoxina ZEA. Básicamente, a través de esta nueva disposición se deben diferenciar los metabolitos en orina, ya que la ingesta de ZEA en los alimentos hace que se encuentre en la orina, ZEA, α-ZEA, β-ZEA, α-ZAL y β-ZAL en cambio el uso de implante de zeranol produce en orina principalmente β-ZAL (talarenol).
Por otro lado, el hecho de encontrar nuevamente contaminación con ZEA y derivados durante un segundo muestreo, realizado 3 años más tarde que el primero, y durante diferentes meses del año, nos permite asegurar que la contaminación natural de pastos pertenecientes a las flia. Poaceae con ZEA no fue un hecho fortuito de un año en particular. Considerando el total de muestras analizadas (67), 58 (87%) mostraron contaminación con ZEA en niveles que variaron de 0,30-711,78 µg/kg (media= 39,96 µg/kg). También se observó que 7 muestras de pasto presentaban co-contaminación con ZEA y α-ZEA, ambos precursores del zeranol, y que 5 muestras mostraron co-ocurrencia de ZEA, α-ZEA y β-ZEA.
Nuestros resultados se complementan con otros obtenidos por investigadores del INTA, quienes recolectaron 11 muestras de pastos (Choris spp., Setaria spp., Cynodon spp., Leersia spp.) durante el mes de julio de los años 2012 y 2013 en otras localidades de la provincia de Chaco y determinaron la presencia de ZEA mediante análisis por HPLC, encontrando un 45% y un 54% de muestras contaminadas con ZEA en niveles que variaron de 2 a 1280 µg/kg, y de 2 y 296 µg/kg, en el año 2012 y 2013, respectivamente (Salvat et al., 2016). Como puede observarse los niveles de toxina son comparables entre este estudio y los nuestros, no así los porcentajes de muestras positivas, pero hay que resaltar que la metodología de detección utilizada por los investigadores del INTA es menos sensible que la utilizada en el presente estudio. Ambos estudios ponen en evidencia la incidencia de ZEA en pastos naturales.
Con respecto a la incidencia de otras micotoxinas en los pastos, el hallazgo de tricotecenos tipo A: T-2, HT-2, NEO y DAS (detectadas en 2011 y 2014) es de importancia ya que su ingesta podría causar síntomas clínicos como irritación severa del tracto digestivo superior, inmunosupresión en ganado, infertilidad bovina y aborto en el último trimestre de la gestación (Zain, 2011). Es importante destacar que tanto T-2 como HT-2 fueron detectadas en altas concentraciones en algunas muestras (5000 µg/kg), pero en general las concentraciones fueron bajas. Con la excepción de T-2 el ganado bovino no se ve afectado por otros tricotecenos. El hecho de haber encontrado altos niveles de tricotecenos tipo A (especialmente T-2 y HT-2) en el presente estudio, puede deberse a la contaminación de los pastos con especies de Fusarium con habilidad de producir estas micotoxinas. Con respecto a los tricotecenos tipo B, NIV y DON fueron los únicos encontrados en las muestras de pastos naturales, con muy bajas frecuencias y niveles durante el año 2011. El ganado bovino es resistente a los efectos eméticos del DON, pero en rumiantes se reduce el consumo de alimento cuando se encuentra en concentraciones de 10-20 mg/Kg (Osweiler, 2000). Durante el presente trabajo, DON se detectó en pocas muestras (n = 9) y en concentraciones más bajas que el nivel recomendado por la Comisión Europea para la alimentación bovina (500 µg/kg). Por otra parte, se detectó contaminación con NIV en las muestras analizadas, con baja prevalencia (22% y 3%) y en niveles inferiores a 831,80 μg/kg. Los niveles encontrados son comparables con otros reportados a nivel mundial (Schollenberger et al., 2006; Sulyok et al., 2007; Eckard et al., 2011; Streit et al., 2012, Van Asselt et al., 2012).
Se detectaron en las muestras de pastos también 2 toxinas modificadas ZEA-4S (presente en ambos años muestreados) y HT-2-G (presente sólo en el año 2014), siendo esto importante ya que se postula que las formas modificadas de una micotoxina probablemente ejerzan la misma toxicidad que el compuesto original (EFSA, 2011). En ambos años se detectaron en altas frecuencias y concentraciones BEA y ENN B, sin embargo, no existe información acerca de la toxicidad para el ganado bovino de estas micotoxinas (Shimshoni et al., 2013). Fumonisina B1 fue la única fumonisina detectada y sólo estuvo presente en 13 muestras del total analizado (173) y en niveles inferiores a 500 µg/kg, sin embargo, estas micotoxinas no son degradadas en el rumen y son eliminadas en las heces de rumiantes (Reyes Velasquez, 2011).
Si bien existen escasas evidencias científicas con respecto a los efectos negativos de la ingestión de micotoxinas sobre el estado de salud y el rendimiento del ganado bovino, en general, se supone que dentro del rumen la población protozoaria tiene la capacidad para detoxificarlas, pero esto puede variar entre las diferentes clases de micotoxinas, dado que, hallazgos clínicos demuestran que algunas son capaces de deteriorar la microbiota ruminal (Streit et al., 2012, Hadley et al., 2006, Wenz et al., 2007). Sin embargo, es un tema que todavía debe ser estudiado en profundidad. Por otro lado, la co-ocurrencia de micotoxinas observada en el presente estudio es relevante teniendo en cuenta sus posibles efectos sinérgicos, antagónicos o aditivos sobre la microbiota ruminal. Esto debería generar preocupación ya que las contaminaciones múltiples pueden representar un riesgo para la producción y la salud del ganado (Changwa et al., 2018). Sumado a esto, la contaminación con micotoxinas de Fusarium en pastos naturales que son consumidos por ganado bovino parece no ser un fenómeno esporádico, sino que ocurre a lo largo del todo el año y en diferentes años como pudo observarse durante el presente estudio.
En su conjunto, el presente estudio aporta datos nuevos y originales en cuanto a la presencia de múltiples metabolitos de Fusarium en pastos naturales (no cultivadas) usados para alimentación bovina. Algunos metabolitos presentes, como tricotecenos tipo A (T-2 y HT-2), la ZEA y sus derivados son motivo de preocupación para los rumiantes, ya que el riesgo depende directamente de su nivel en el alimento, la presencia simultánea y cantidad de otras micotoxinas, y de la edad y estado de salud del animal. Además, los estudios realizados en febrero y septiembre de 2014 indicarían que no hay una variación estacional en cuanto al tipo y concentración de las micotoxinas detectadas en pastos. Sin embargo, el principal aporte de este trabajo radica en poder explicar que los niveles de ZEA y sus derivados (α y β ZEA) encontrados en los pastos naturales analizados serían suficientes para que una vez consumidos por el ganado bovino puedan biotransformarse en el rumen e hígado y por lo tanto encontrase en orina tanto zeranol (α-ZAL), como ZEA y sus derivados.
Este artículo corresponde al capítulo II de la Tesis Doctoral presentada por la primera autora bajo la dirección de la Dra. Ramirez y codirección de la Dra. Torres.
Articulo original ha sido publicado en Toxins 2015, 7, 3309-3329; doi:10.3390/toxins7083309
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por SECYT-UNRC, PIP-CONICET y SENASA (Segundo premio a la Investigación y Transferencia en Protección Vegetal 2014 de Equipos Consolidados). La Dra. Nichea es becaria de CONICET y las Dras. Torres y Ramírez son miembros de la Carrera de Investigador Científico de CONICET.
